免疫荧光实验流程

单标记方法

免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。

1、所需材料与试剂

a, 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。

b, 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。

d, 封闭液。

e, 0.01mol／LPBS缓冲液。

2、染色方法

a, 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。阻断血清选择与二抗同一种属的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。抗体以0.01 mo/LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用滤纸吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。

双标记方法

免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。此方法稍微复杂一些，应注意所用的一抗是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。其次，两种二抗所带荧光素的发射光不应重叠，且尽量远离，通常可以选择FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等来组合。通常情况下，染色时两种一抗可以同时孵育，然后可以同时孵育两种二抗。但当染色结果一种颜色非常弱，而另一种颜色比较强时，应考虑先孵育颜色较弱的二抗。其他步骤同免疫荧光单标记。

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